Le marquage de l’ADN double brin est réalisé par la technique d’amorçage aléatoire multiple (Feinberg et Volgestein, 1983). La matrice (25 ng) est dénaturée par la chaleur pendant 5 min, puis conservée dans la glace. Elle est ensuite mise en contact avec un mélange d’hexanucléotides, le fragment Klenow de l’ADN polymérase d’E.coli (dépourvu d’activité exonucléase 5’-3’), et des 4 dNTP dont l’un est radiomarqué. Les hexanucléotides hybridés sur la matrice constituent les amorces 3’-OH indispensables pour la synthèse du brin complémentaire radioactif, qui est réalisé à 37°C pendant 30 min.
La préparation des sondes est réalisée à l’aide du kit « PRIME-IT » (Stratagene), en utilisant 1,85 MBq (50 μCi) de précurseur radioactif, α-32PdCTP]] (3000 Ci.mmoles-1, Amersham). L’ADN radiomarqué est séparé des nucléotides libres par passage sur une colonne Séphacryl S-300 (Pharmacia). La radioactivité incorporée est évaluée sur une fraction de 1 μL en présence de liquide de scintillation à l’aide d’un compteur à scintillation.
2. Hybridation.
Les hybridations sont réalisées dans un four à hybridation. Les températures de préhybridation, d’hybridation et de lavages des membranes varient selon le degré d’identité entre la sonde et l’ADN cible. En conditions optimales la température est fixée à 65°C. Les membranes de nylon ou de nitrocellulose sont préhybridées pendant au moins 2 h dans du tampon d’hybridation. L’hybridation est effectuée pendant 16 h à la même température dans du tampon d’hybridation contenant la sonde préalablement dénaturée par la chaleur (10 min à 100°C), à raison de 106 cpm/mL de tampon. Les lavages sont réalisés à la même température, deux fois 15 min dans une solution SSC 2X, SDS 0,1% (p/v) et une fois 15 min dans une solution SSC 0,1X, SDS 0,1% (p/v).
Les membranes sont ensuite mises à autoradiographier à -80°C entre deux écrans amplificateurs.
Tampon d’hybridation
Denhardt 5X
SSC 6,6X
SDS 0,5% (p/v)
ADN de sperme de saumon dénaturé 100 μg.mL-1
Denhardt 50X
Ficoll 1% (p/v)
Polyvinylpyrrolidone 1% (p/v)
BSA 1% (p/v)
SSC 10X
NaCl 1,5 M
Citrate de sodium 150 mM