Principe :

    Pas la peine de réinventer la roue, la PCR est bien expliquée sur Wikipedia. Le but du jeu étant de donner la composition précise d'une réaction enzymatique.

    

    Un seul type de réaction est prise en compte ici : les réactions avec l'Amplitaq (appelée aussi "Yellow Taq") étant donné que les conditions de réactions pour les autres enzymes sont spécifiées dans leur manuel d'utilisation.

    

 

    Hygiène et sécurité :

    blabla

    

 

    Matériel nécessaire :

 

+    

 

• 
          Tubes 0.2ml (individuels ou en barrettes de 8) ou plaque 96 puits pour PCR.
      
• 
          Cycleur PCR.
      
• 
          Jeu de pipettes et pointes de pipettes DNAse-free.

 

     Réactifs :

 

+    

 

• 
          Eau DNAse-free
      
• 
          Tampon de polymérase 10X : Tris pH8.3 0.5M, Sucrose 10%, Ficoll 5%, KCl 0.3M, MgCl2 30mM, Tartrazine 10mM (soit pour 50ml : 25ml de Tris 1M, 5g de sucrose, 2.5g de ficoll, 5ml de KCl 3M, 1.5ml de MgCl2 1M et 2ml de tartrazine 250mM). Mélanger le tout, aliquoter par 1ml, stocker à -20°C.
      
• 
          Mélange de dNTP contenant 20mM de chaque (soit pour 1ml : 200µl de dATP, 200µl de dTTP, 200µl de dCTP, 200µl de dGTP et 200µl d'eau DNAse-free). Mélanger le tout, aliquoter par 20µl et stocker à -20°C.
      
• 
          Amorces (oligonucléotides ou "oligo" ou "primers")
      
• 
          Taq ADN polymérase Amplitaq
      
• 
          Matrice ADN : à priori 0.1 à 1µl d'ADNc, 1 à 5µl d'ADNg, 0.01 à 1µl de plasmide ou un peu de colonie bactérienne.

 

    Mode opératoire :

 

    Composition d'une réaction de PCR

 

Concentration finale
Vf=50 µl
Vf=25 µl
Eau DNAse-free
qsp Vf
~42.5
~21.3
Tampon Y-Taq 10x
1x
5
2.5
dNTP 20mM
200µM
0.5
0.25
Amorce 5' 10µM
100nM
0.5
0.25
Amorce 3' 10µM
100nM
0.5
0.25
Y-Taq 1u/µl
1u/50µl
1
0.5
matrice
variable
<1ùl

     Programmation :

 

+    

 

1. 
           (Optionnel) 1 étape de dénaturation à 95°C pendant 1min
       
2. 
           35 cycles composés chacun de :
           
   +            
   1. 
                      1 étape de dénaturation à 95°C pendant 20s
                  
   2. 
                      1 étape d'hybridation des amorces à (Tm - 3)°C pendant 20s
                  
   3. 
                      1 étape d'élongation à 72°C pendant 1min/Kbp
              
   
       
       
3. 
           (Optionnel) 1 étape d'élongation finale à 72°C pendant 1min/Kbp
       
4. 
           (Optionnel) 1 étape de stockage au froid à 4/15°C pendant un temps indéfini

 

    Vérification du produit de PCR :

    1/10ème du volume de chaque réaction de PCR (2.5 à 5µl) est simplement passé sur un gel d'électrophorèse (agarose 1 à 1.5% selon la taille attendue du produit) et visualisé aux UV.

    

 

     Références :

    blabla