Principe :
Hygiène et sécurité :
Les déchets organiques issus de plantes transgéniques ou de mutants sont jetés dans la poubelle Biohazard.
Matériel nécessaire :
- Boîtes de pétri de 50mm.
- Pinces fines nettoyées avec un papier absorbant imbibé d'alcool entre chaque plante.
- Microscope inversé.
- (Optionnel) Compteur
Réactifs :
- Tampon de germination : MES 20mM (pH 6 en cas d'utilisation de solution-mère au lieu de poudre), Ca(NO3)2 tétrahydraté 3mM, KCl 1mM, MgSO4 0.8mM, Acide Borique 1.6mM, Sucrose 2.5% (p/v) et PEG-4000 24% (p/v). Après la préparation, ajuster le pH à 6 avec du KOH.
NB : la réussite de la germination des grains de pollen est principalement conditionnée par un pH correct et donc d'un ajustement de pH a posteriori (le PEG modifie le pH) et de l'utilisation d'un tampon MES de qualité.
Mode opératoire :
Test de germination :
- Verser jusqu'à 1mL de tampon dans une boite de pétri 50mm.
- Prélever les étamines d'une fleur au stade de l'anthèse (fleur totalement ouverte).
- Dans la boite de pétri, avec une pince, éventrer les étamines pour faire tomber le pollen dans le tampon (on voit un léger nuage se disperser dans le tampon).
- Laisser germer 3-4h à l’obscurité et à température de la serre (pour ne pas créer de choc thermique en les transportant jusqu'au laboratoire).
- Une fois ce temps écoulé, ramener les boites de pétri et observer la germination grâce à un microscope inversé.
- Pour faciliter la visualisation, poser une lamelle d'histologie sur le tampon : les grains de pollen sont ainsi tous cantonnés sur le même plan d'observation.
Remarques :
- Toujours faire la comparaison avec une plante sauvage.
- Le tube pollinique peut sortir du grain de pollen et éclater : ces cas sont comptabilisés dans les grains de pollen germés.
- Penser à faire jouer la mollette de focalisation car les grains de pollen sont répartis sur toute l’épaisseur du liquide.
- Compter environ 200 grains de pollen pour chaque fleur et environ 1000 à 2000 pour déterminer le % de germination des grains de pollen d’une plante.