Principe :

Le mélange Phénol/Chloforme a une densité plus haute que celle de l'eau et en créant une émulsion entre une solution aqueuse et ce mélange, les protéines, qui ont une meilleure affinité pour le phénol et le chloroforme, passent dans la phase organique ou restent à l'interphase. Ici, le phénol et le chloroforme ont tous les deux le même rôle vis à vis des protéines (mis à part le phénol qui, en plus, dénature les protéines). Mis ensemble, l'extraction des protéines est plus efficace. L'alcool isoamylique a pour rôle de stabiliser l'interphase (en augmentant la tension superficielle ?) et rendre le pipettage plus facile.

Après l'extraction des protéines par le phénol/chloroforme, il faut enlever les traces de phénol de la phase aqueuse en utilisant un mélange de chloroforme/alcool isoamylique. Lors de l'émulsion, les traces restantes de phénol passent donc dans la phase organique.

Notes :
 

• L'alcool isoamylique (utilisé avec le chloroforme) est facultatif.
• Dans l'étape de déprotéinisation, le phénol ou le chloroforme peuvent être utilisés seuls. Exemple 1 : Une étape de déprotéinisation au phénol, une ou deux étapes de lavage au chloroforme (avec ou sans alcool isoamylique). Exemple 2 : seulement une étape de déprotéinisation au chloroforme.
• Plus on utilise d'étapes et plus la solution finale sera pure. Mais à cause des pertes de volume à chaque étape, la quantité finale sera moins grande.

 

Hygiène et sécurité :

• Le phénol et le chloroforme étant des produits toxiques et volatiles, ceux-ci doivent être manipulés sous une hotte aspirante à flux vertical (ou sorbonne).
• De plus, la haute toxicité du phénol nécessite de manipuler à l'aide de gants en nitrile moins poreux que les gants en latex.
• Les déchets toxiques liquides sont éliminés dans la poubelle pour solvants organiques halogénés. Le chlore de la molécule de chloroforme étant un atome halogène.
• Les déchets solides comme les tubes et les pointes souillés sont éliminés dans la poubelle pour déchets solides CMR.

 

Matériel nécessaire :

• Au moins 2 tubes neufs DNAse-free ou RNAse-free pouvant contenir le double du volume de la solution d'acides nucléiques à purifier (1.5ml minimum).
• Un hotte aspirante.
• Des gants en nitrile.
• Des pointes de pipette DNAse-free ou RNAse-free (selon la nature des acides nucléiques à purifier).
• Un vortex
• Une centrifugeuse pouvant aller au moins jusqu'à 10000 G et réglée à vitesse maximale.

 

Réactifs :

• Mélange Chloroforme/Alcool isoamylique : 24 volumes de chloroforme pour 1 volume d'Alcool isoamylique soit, par exemple, 48 ml de chloroforme et 2 ml d'alcool isoamylique. Stocker à 4°C.
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Mélange Phénol/Chloroforme/Alcool isoamylique : 25 volumes de Phénol, 24 volumes de Chloroforme pour 1 volume d'Alcool isoamylique soit 10 ml de phénol et 10 ml de mélange Chloroforme/Alcool isoamylique. Stocker à 4°C dans une bouteille en verre fumé.

• • Pour l'ADN, utiliser du phénol tamponné ("Buffer saturated") au Tris pH 8.
  • Pour l'ARN, utiliser du phénol saturé à l'eau ("Water saturated") au pH ~4.

 

Mode opératoire :

1ère étape de déprotéinisation au phénol :

1. Sous hotte, avec des gants en nitrile : Ajouter à votre solution d'ADN ou d'ARN un volume du mélange Phénol/Chloroforme/Alcool isoamylique adéquat (Rappel : avec du phénol acide pour les ARN, avec du phénol tamponné pour les ADN).
2. Vortexer suffisamment longtemps pour obtenir une émulsion entre la phase aqueuse (contenant les acides nucléiques) et la phase organique (contenant le phénol et le chloroforme).
3. Centrifuger au moins 2 min.
4. Sous hotte : Récupérer la phase aqueuse dans un tube neuf. Jeter la phase organique dans la poubelle à déchets liquides halogénés et le tube souillé dans la poubelle à déchets solides CMR.

 

2ème étape de déprotéinisation au phénol (Optionnelle) :

Pour être certain de se débarrasser de toutes les impuretés, la première étape de déprotéinisation au phénol peut être répétée exactement comme précédemment.
 

1ère étape de lavage au chloroforme :

1. Sous hotte, avec des gants en nitrile : Ajouter un volume de mélange Chloroforme/Alcool isoamylique.
2. Vortexer pour obtenir une émulsion.
3. Centrifuger au moins 1 min.
4. Sous hotte : Récupérer la phase aqueuse dans un tube neuf. Jeter la phase organique dans la poubelle à déchets liquides halogénés et le tube souillé dans la poubelle à déchets solides CMR.

 

2ème étape de lavage au chloroforme (Optionnelle) :

Pour se débarasser complètement de toute trace de phénol, on peut répéter l'étape de lavage au chloroforme.
 

Références :