Extraction

 

- Prélever des feuilles vertes (environ 5) et les déposer dans un tube ependorf 1,5ml (ciseaux + pince)

- Conserver les tubes dans la glace pour éviter que les ADN ne se dégradent

- Ecraser les feuilles à l’aide d’un piston bleu pendant 15 secondes

- Ajouter 300µl de tampon d’extraction et broyer pendant 15 secondes supplémentaires

- Incuber 15 min à 50°C dans un bain marie

- Centrifuger 5min à 13 000 rpm à température ambiante

- Préparer tubes propres contenant 250 µl d’isopropanol

- Prélever 250µl de surnageant et les ajouter aux 250 µl d’isopropanol à agiter manuellement

- Incuber 20 min à température ambiante (sur plaque agitante ; vitesse 350)

- Centrifuger 20 min à 13 000 rpm à température ambiante

- Retirer le surnageant

- Laver le culot avec 300µl d’EtOH 70%

- Enlever le surnageant

- Laisser sécher la nuit recouvert d’un papier absorbant (essuie tout)

- Reprendre le culot dans 40ml de tampon TE pH = 8, dans la glace

- Vortexer brièvement

- Centrifuger brièvement

- Mesurer la concentration de l’ADN au Nanovue

- Les placer dans la glace le temps de réaliser les mix de PCR

 

Tampon d’extraction :

 

Pour 40ml de tampon

            Tris-HCl     1M                                  8 ml

            NaCl          5M                                   2 ml (ou 3,4mL pour 3M)

            EDTA        0.5M                                2 ml

            SDS          10%                                  2 ml

            H2O MQ                                            qsp à 40 ml dans un tube falcon

+ filtration sur filtre 0.22 µL

 

N.B : Ne pas faire plus de 8 échantillons par manip pour limiter la dégradation des ADN.

 

Utilité des composants du tampon :

- NaCl : joue sur la pression osmotique dans le but de faire éclater les cellules.

- SDS : pour linéariser l’ADN, il dénature et précipite les protéines. Étant chargé positivement, il neutralise les charges négatives de l’ADN

- EDTA : Bloque les nucléases

- Tris : tampon

- Bain marie : pour  que le tampon d’extraction soit plus efficace

- Isopropanol : pour précipiter l’ADN

- Ethanol : pour laver l’isopropanol

 

 

Mix de PCR :

 

Pour 1 tube :

- H2O mQ                                                                 16.6 µl

- Tampon Taq 5X                                                       5 µl

- p3’                                                                           0.5 µl

- p5’                                                                           0.5 µl

- dNTP                                                                      0.2 µl

- GoTaq                                                                     0.2 µl

- ADN pur                                                                 2 µl

 

Programme de PCR :

                       

94°C    à        3min

35 cycles

 

                        94°C    à        30 sec

                        53°C    à        30 sec

                        72°C    à        2 min 30 sec

                        72°C    à        5 min