Extraction d'ADN plasmidique (méthode PEG-MgCl2)

Principe :

Ce mode opératoire est utilisé principalement pour préparer l'ADN plasmidique en vue d'un séquençage. La lyse alcaline et la précipitation à l'isopropanol assurent le rendement (alors qu'une étape avec une colonne de silice réduit celui-ci), les étapes de déprotéinisation et de précipitation au PEG-MgCl2 assurent une pureté suffisante pour qu'on puisse se servir du plasmide comme matrice de séquençage.

Le seul véritable défaut de ce protocole est sa durée. Il vaut mieux utiliser ce protocole la veille de l'envoi au séquençage.

Durée :

2h

Cout :

 

Matériel de départ :

  • 1 à 1,5 ml de culture liquide de bactéries saturée. Astuce : le milieu Terrific Broth (TB) multiplie la production de plasmide par 2 ou 3.
  • 3 microtubes de 1,5ml propres (c'est-à-dire à peine sortis de leur sachet d’origine) par échantillon.
  • 1 microtubes de 1,5ml DNAse-free (c'est-à-dire stérilisés mais pas nécessairement stériles) par échantillon.
  • Centrifugeuse (pas nécessairement réfrigérée) pour tubes eppendorfs réglée à vitesse maximale.
  • Une hotte aspirante.

Solutions nécessaires :

  • Tampon STE : NaCl 100 mM, Tris pH 8 10 mM, EDTA 1 mM (soit 1,6 ml de NaCl 3 M, 5  ml de TE 10x et eau DNAse-free qsp 50 ml). Stocker à température ambiante.
  • Tampon de resuspension (ou TEG) : Tris pH 8 25 mM, EDTA 10 mM, Glucose 50 mM, RNAse A 20 µg/ml ajoutée extemporanément (soit 1,25 ml de Tris 1 M, 1 ml d’EDTA 0,5 M et 450 mg de Glucose et eau mQ qsp 50 ml. 2 µl de RNAse 10 mg/ml pour 1 ml de Tampon TEG). Stocker le TEG sans RNAse à 4°C.
  • Tampon de lyse : NaOH 0,2 M, SDS 1 % (soit 5 ml de NaOH 2 M, 5 ml de SDS 10 % et eau DNAse-free qsp 50 ml).
  • Tampon de neutralisation : Acétate de Potassium 3M, Acide acétique 2M (soit 30ml de KAc 5M (ou 20g de KAc*2H2O ou 14,7 g de KAc anhydre), 6,75 ml d’acide acétique glacial et eau DNAse-free qsp 50 ml).
  • Isopropanol
  • Ethanol 70 %
  • Tampon TE 1x : Tris pH 8 10 mM, EDTA 1 mM (soit, pour 50 ml de TE 10x, 5 ml de Tris 1 M, 1 ml d’EDTA 0,5 M et eau mQ qsp 50 ml. Autoclaver le tout). Stocker à température ambiante.
  • Phénol/chloroforme/alcool isoamylique : proportions 25/24/1 (soit 1 volume de phénol tamponné (pH 7,8 - 8,2) pour 1 volume de mélange chloroforme/alcool isoamylique. Laisser décanter quelques heures). Stocker à 4 °C. Attention toxique, manipuler sous hotte aspirante et corrosif pour le plastique en polystyrène !
  • Chloroforme/alcool isoamylique : proportions 24/1 (soit 1 ml d’alcool isoamylique pour 24 ml de chloroforme). Stocker à 4 °C. Attention toxique, manipuler sous hotte aspirante et corrosif pour le plastique en polystyrène !
  • PEG-MgCl2 : PEG-6000 40%, MgCl2 30mM (soit 20 g de PEG-6000 et 305 mg de MgCl2*6H2O (ou 1,5 ml de MgCl2 1 M) et eau DNAse-free qsp 50 ml. Autoclaver le tout). Stocker à température ambiante.
  • Eau DNAse-free

Mode opératoire :

Lyse alcaline :

  1. Répartir la culture bactérienne dans des microtubes de 1,5 ml propres. Centrifuger au moins 5 min. Vider le surnageant (poubelle « déchets bactériens »).
  2. Ajouter 1 ml de STE. Vortexer jusqu’à resuspension des cellules. Centrifuger au moins 5 min. Vider le surnageant (poubelle « déchets bactériens »).
  3. Ajouter 170 µl de Tampon de resuspension. Vortexer jusqu’à resuspension des cellules.
  4. Ajouter 340 µl de Tampon de lyse. Homogénéiser doucement si ça s’est mal mélangé lors de l’ajout du tampon. Attendre 5 min à température ambiante.
  5. Ajouter 340 µl de Tampon de neutralisation. Agiter doucement pour homogénéiser. Centrifuger au moins 5 min.
  6. Transférer ~850 µl de surnageant dans un nouveau microtube de 1,5 ml propre.

Précipitation à l'isopropanol :

  1. Ajouter 600 µl d’Isopropanol (soit 0,7 volume). Homogénéiser et centrifuger au moins 10 min. Vider le surnageant.
  2. Ajouter 1 ml d’éthanol 70 %. Vortexer brièvement. Centrifuger au moins 5 min.
  3. Enlever soigneusement le surnageant à la pipette. Sécher au Speedvac au moins 5 min.
  4. Resuspendre jusqu’à homogénéisation complète dans 200 µl de TE 1x.

Déprotéinisation au phénol :

  1. Sous hotte, ajouter 200 µl de Phénol/Chloroforme/Alcool isoamylique. Vortexer 1 min. Centrifuger au moins 5 min.
  2. Sous hotte, récupérer les 200 µl de phase aqueuse (celle d’en haut) dans un microtube propre en évitant absolument de pipeter les protéines situées à l’interface. Jeter la phase organique dans la poubelle de solvants halogénés.
  3. Sous hotte, ajouter 200 µl de Chloroforme/Alcool isoamylique. Vortexer 1min. Centrifuger au moins 1 min. Sous hotte, récupérer soigneusement la phase aqueuse dans un microtube de 1,5 ml DNAse-free. Jeter la phase organique dans la poubelle de solvants halogénés.

Précipitation au PEG-MgCl2 :

  1. Ajouter 100 µl de PEG-MgCl2 (soit un demi volume). Vortexer. Attendre au moins 10 min à température ambiante. Centrifuger au moins 20 min. Eliminer le surnageant.
  2. Ajouter 1 ml d’éthanol 70 %. Vortexer brièvement. Centrifuger au moins 5 min. Eliminer le surnageant.
  3. Ajouter 250 µl d’éthanol 70%. Vortexer brièvement. Centrifuger au moins 5 min. Enlever soigneusement le surnageant à la pipette.
  4. Sécher au Speedvac au moins 5 min.
  5. Resuspendre dans 100 µl d’eau DNAse-free et homogénéiser.