Durée :

Cout :

Matériel de départ :

• 1 à 1,5 ml de culture liquide de bactéries saturée. Astuce : le milieu Terrific Broth (TB) multiplie la production de plasmide par 2 ou 3.
• Microtubes de 1,5 ml DNAse-free (c'est-à-dire stérilisés mais pas nécessairement stériles) par échantillon.
• Centrifugeuse (pas nécessairement réfrigérée) pour tubes eppendorfs réglée à vitesse maximale.

Solutions nécessaires :

• Tampon de resuspension (ou TEG) : Tris pH 8 25 mM, EDTA 10 mM, Glucose 50 mM, RNAse A 20 µg/ml ajoutée extemporanément (soit 1,25 ml de Tris 1 M, 1 ml d’EDTA 0,5 M et 450 mg de Glucose et eau mQ qsp 50 ml. 2 µl de RNAse 10 mg/ml pour 1 ml de Tampon TEG). Stocker le TEG sans RNAse à 4°C.
• Tampon de lyse : NaOH 0,2 M, SDS 1 % (soit 5 ml de NaOH 2 M, 5 ml de SDS 10 % et eau DNAse-free qsp 50 ml).
• Tampon de neutralisation : Acétate de Potassium 3 M, Acide acétique 2 M (soit 30 ml de KAc 5 M (ou 20 g de KAc*2H2O ou 14,7 g de KAc anhydre), 6,75 ml d’acide acétique glacial et eau DNAse-free qsp 50 ml).
• Isopropanol
• Ethanol 70 %
• Eau DNAse-free

Mode opératoire :

Lyse alcaline :

1. Ajouter 1 ml de culture bactérienne dans un microtube de 1,5 ml. Centrifuger au moins 5 min à vitesse maximale. Vider le surnageant (poubelle « déchets bactériens »).
2. Ajouter 170 µl de Tampon TEG. Vortexer jusqu’à resuspension des cellules (alternative : racler les tubes sur un portoir).
3. Ajouter 340 µl de Tampon de lyse. Homogénéiser doucement si ça s’est mal mélangé lors de l’ajout du tampon. Attendre 5 min à température ambiante ou jusqu'à ce que le mélange devienne translucide (les cellules se lysent).
4. Ajouter 340 µl de Tampon de neutralisation. Agiter doucement pour homogénéiser. Centrifuger au moins 5 min à vitesse maximale.
5. Transférer ~850 µl de surnageant dans un nouveau microtube de 1,5 ml propre.

Précipitation à l'isopropanol :

1. Ajouter 600 µl d’Isopropanol (soit 0,7 volume). Homogénéiser et centrifuger au moins 10 min à vitesse maximale. Vider le surnageant.
2. Ajouter 1 ml d’éthanol 70 %. Vortexer très brièvement. Centrifuger à vitesse maximale au moins 5 min.
3. Enlever soigneusement le surnageant à la pipette. Recentrifuger brièvement pour récupérer les dernières gouttes. Enlever le reste d'éthanol soigneusement. Sécher au Speedvac au moins 5 min ou sous une pompe à vide au moins 15 min.
4. Resuspendre jusqu’à homogénéisation complète dans 20 µl d'eau DNAse-free.