Digestion enzymatique pour ligation
Les plasmides E6c et E6n, ainsi que les fragments extraits sont digérés par les enzymes BamH1 et Not1 simultanément.
Préparation du plasmide E6c (179ng/µl) : 2 tubes préparés
- plasmide : 11.7µl (qsp 2µg de plasmide)
- Not1 : 2µl
- BamH1 : 2µl
- Tampon D : 4µl
- BSA : 5µl
- H2O qsp 50µl : 25.3µl
Purification de produits de digestion
Une fois que la digestion a pris fin, les produits de digestion sont purifiés selon le protocole suivant :
- ajouter 150µl de TE pH8
- ajouter 200µl d’un mélange phénol / chloroforme / acide isoamylique (25 : 24 : 1)
- vortexer et incuber 2 minutes à température ambiante
- centrifuger 5min à 13000g
- récupérer proprement la phase aqueuse dans un nouveau tube (environ 180µl)
- ajouter 180µl de chloroforme
- vortexer
- centrifuger 5min à 13000g
- récupérer la phase aqueuse dans un nouveau tube et ajouter 1/10v d’acétate de sodium
- agiter
- ajouter 6/10v d’isopropanol
- agiter
- centrifuger 30min à 13000g à 4°C
- sécher par vacuum et resuspendre le culot dans 15µl de tampon TE
Ligation
La ligation se fait à partir des vecteurs et des fragments digérés et purifiés.
Les quantités de vecteur et fragment à insérer sont déterminées par la règle suivante :
Qinsert = (Qvecteur x taille insert / longueur vecteur) x 5/1
Préparation de la ligation
| Plasmide pE6N | |
| Plasmide pE6C | |
| Plasmide | |
| 1.5 | |
| 1.5 | |
| Fragment | |
| 1.2 | |
| 1.2 | |
| Buffer | |
| 2 | |
| 2 | |
| Ligase T4 | |
| 0.5 | |
| 0.5 | |
| H2O qsp 20µl | |
| 14.8 | |
| 14.8 | |
Arrêt de ligation
Après une ligation overnight, celle ci est arrêtée par incubation 10min à 65°C.
Transformation de bactéries
Des bactéries TOP10 sont transformées avec 1µl de produit de ligation.
Ces bactéries sont transformées par électroporation puis étalées (200µl de transformation) sur milieu LB + kanamycine.