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Préparation de bactéries électrocompétentes (Thomas)

    Le principe de ce mode opératoire ne change pas énormément par rapport à l'officiel (celui sur le serveur feu-Higgins) sauf certains points :

 


  •         Manipulations "énergiques" et à température ambiante : traditionnellement, si on lave les cellules après la culture en les conservant le plus possible dans la glace, c'est principalement pour les empêcher de se multiplier au delà du seuil limite DO=0,6 et non pas parce qu'elles sont fragiles. Les bactéries se fragilisent surtout lors de la congélation/décongélation, moins avant. On peut facilement contourner cet hypothétique problème de multiplication "post-culture" en arrêtant la culture un peu plus tôt, à une DO de ~0,500 - 0,550. Au final il y aura un peu moins de cellules mais elles seront tout autant, sinon plus, compétentes qu'avec le mode opératoire traditionnel. Les bactéries seront donc resuspendues rapidement et efficacement avec une pipette de sérologie et ce sans ce soucier de la température à laquelle on procède. Sur un même temps imparti, ceci nous permet de faire plus de lavages qu'en prenant moult précautions inutiles.

  •         Lavages : deux lavages consécutifs dans un volume de 50ml (facteur de dilution 50x50 = 2500) valent mieux un seul lavage dans 500ml (facteur de dilution = 500). Les lavages peuvent donc être effectués dans des flacons stériles de 50ml.

  •         Maitriser et standardiser la concentration finale : même si les bactéries sont compétentes, si elles ne sont pas suffisamment concentrées dans le tube final, l'efficacité de transformation s'en ressentira. J'ai donc inclus un étape pour ajuster cette concentration à la fin des lavages. Toutes ces étapes de standardisation et de vérification d'efficacité peuvent être utilisées pour d'autres protocoles de préparation de bactéries compétentes.

  •         Le volume de culture initial (en l'occurence 800ml) est arbitraire, ce protocole peut être adapté pour des volumes plus grands ou plus petits, tout dépend de la verrerie et du matériel disponible.


    Hygiène et sécurité :



    Tout le matériel et les solutions souillés par les bactéries doivent être stérilisées par autoclavage avant de les nettoyer/éliminer.

 


     Matériel nécessaire :

 


  •         Hotte à flux laminaire dédiée à cet effet (pas les hottes pour culture in vitro de plantes).
        

  •         Incubateur rotatif à température réglable (28°C pour Agrobacterium, 37°C pour E.coli) pour les cultures liquides (ex : InForce).
        

  •         Erlens stériles.
        

  •         Une ou deux boites de pétri.
        

  •         Ensemenceur stérilisable.
        

  •         Etuve à température réglable (28°C pour Agrobacterium, 37°C pour E.coli) pour les cultures solides.
        

  •         Spectrophotomètre et cuves jetables.
        

  •         4 à 8 flacons de 50ml stériles qui résistent à la centrifugation (ex: en polypropylène).
        

  •         Centrifugeuse réfrigérée (ou qui ne surchauffe pas les échantillons) avec rotor pour flacons de 50ml.
        

  •         Pipettes de sérologie stériles de 10 ou 25ml et une propipette électrique.
        

  •         Plein de tubes eppendorfs de 0.5ml stériles (1 pot).
        

  •         Pipettes et pointes de pipettes stériles.


      Réactifs :

 


  •         ~800ml d'eau déminéralisée stérile (soit 2 bouteilles de la réserve d'eau stérile).
        

  •         800ml de milieu SOB ou LB additionné des antibiotiques adéquats.
        

  •         10ml de LB (liquide) additionné des antibiotiques adéquats.
        

  •         un peu de milieu LB solide additionné des antibiotiques adéquats.
        

  •         souche bacterienne à multiplier.
        

  •         ~100ml de glycérol 10% stérile.


     Mode opératoire :



    La journée la plus prenante est celle de la culture des bactéries et des centrifugations/lavages à suivre, c'est la journée J-0.

 


       Pré-cultures

 


  1.         Avec une anse de platine (ou l'équivalent) stérilisée à la flamme, prélever un peu de souche bactérienne (colonie, stock glycérol, cellules électrocompétentes, etc.) et étaler sur une boite de pétri contenant du LB solide et des antibiotiques de façon à séparer les UFC. Incuber la nuit à 37°C pour E.coli (donc J-2) ou 2 jours à 28°C pour A.tumefasciens (donc J-4). Les cultures solides résultantes peuvent être conservées une petite semaine.

            
        

  2.         Pour E.coli, la veille au soir (J-1) ou l'avant-veille (J-2) au plus tôt dans la journée pour A.tumefasciens : à partir de la culture solide précédente, prélevez une colonie avec un ensemenceur stérile et ensemencer 10ml de LB liquide additionné d'antibiotiques. Incuber avec agitation la nuit à 37°C pour E.coli ou 2 jours et une nuit à 28°C pour A.tumefasciens.


       Culture

 


  •         Pour E.coli :
            

    1.                 le matin (J-0), prélever 1ml des 800ml de milieu SOB (ou LB) additionné d'antibiotiques et mettre dans une cuve de mesure de DO qui servira de blanc pour toutes les mesures de la croissance bactérienne.
                  

    2.                 Ensemencer le SOB au 1/100ème avec de la pré-culture liquide (on peut diluer plus, jusqu'à 1/2000ème, mais ça prend plus de temps, tout dépend du timing souhaité).
                  

    3.                 Prélever 1ml de cette culture pour mesurer la DO à 600nm, c'est la prise t0 qui donne une idée du temps que la culture mettra à atteindre une DO(600nm) de 0,5-0,6.
                  

    4.                 Incuber sous rotation à 37°C et mesurer la DO à 600nm à peu près toutes les heures au début puis plus régulièrement à l'approche de la DO optimale de 0,5-0,6 (sachant que la DO double théoriquement toutes les 30min).

                      
              

        

  •         Pour A.tumefasciens :
            

    1.                 la veille au soir (J-1), prélever quelques ml du SOB additionné d'antibiotiques et réserver au frigo pour s'en servir de blanc le lendemain.
                  

    2.                 Ensemencer le SOB au 1/1000ème (ou au 1/2000ème, toujours en fonction du timing souhaité) avec de la pré-culture.
                  

    3.                 Incuber sous rotation à 28°C pendant toute la nuit.
                  

    4.                 le matin, mesurer la DO à 600nm qui doit normalement être en dessous de 0,5 et, tout en mesurant régulièrement la DO, laisser la culture pousser jusqu'à obtenir une DO à 0,5-0,6 (sachant que la DO est sensée doubler toutes les heures).
                      

      •                         Si, contre toutes attentes, la DO est déjà supérieure à 0,5-0,6, diluer la culture de moitié avec du SOB ou du LB additionné d'antibiotiques (ce qui implique d'en avoir une réserve de secours) et laisser de nouveau pousser jusqu'à atteindre la DO optimale.
                        

              


       Lavages

 


  1.         Centrifuger (3000g, 4°C, 5min) la culture de bactéries et éliminer le surnageant (à autoclaver par la suite).
        

  2.         Effectuer au moins 4 lavages de la façon suivante :
            

    1.                 Reprendre le ou les culots dans de l'eau déminéralisée stérile
                  

    2.                 Centrifuger (4000g, 4°C, 5min)
                  

    3.                 Eliminer le surnageant (à autoclaver par la suite).
              

        

  3.         Reprendre le culot de bactérie avec 40-50ml de glycérol 10%, centrifuger (5000g, 4°C, 5min) et éliminer sommairement le surnageant. Reprendre le culot avec le reliquat de surnageant (qui redescend des parois du tube).
            

    •                 Cette opération fastidieuse donne un concentré de bactéries utilisables en l'état.
              


      Standardisation :

 


  1.         Diluer 2µl de ce concentré dans 1ml de glycérol (1/500ème) et mesurer la DO à 600nm (peu importe dans quoi ces bactéries sont diluées du moment que le blanc est correctement fait). Multiplier ce résultat par 500 pour extrapoler la DO du concentré. Rajouter suffisamment de glycérol 10% pour que la DO du concentré finale soit entre 175 et 200.
            

    •                 Exemple : si la DO de la dilution 1/500ème est de 0.8, la DO du concentré est donc de 400. Il faut diluer le concentré de 1/2 et donc rajouter un volume de glycérol 10%.
                  

    •                 si la DO est déjà trop faible, ne pas diluer.
                  

    •                 Avec cette opération, même si la mesure du volume du concentré et le prélèvement du glycérol sont hasardeux, ça permet d'obtenir des bactéries avec des concentrations à peu près équivalentes d'une préparation à un autre.
              

        

  2.         Aliquoter les bactéries par 40µl dans des tubes de 0,5ml stériles et stocker à -80°C.


    Vérification de l'absence de contamination :

 


  1.         Avec une anse de platine stérilisée à la flamme et refroidie, étaler grossièrement un peu de bactéries (fraiches ou décongelées, qu'importe) sur un panel de boites de LB solide additionnées chacune avec un seul antibiotique parmi ceux qu'on utilise couramment et pour lequel la souche étudiée n'est pas résistante : Kanamycine 50µg/ml, Ampicilline 100µg/ml, Spectinomycine 100µg/ml et parfois Chloramphénicol 10µg/ml (pour les E.coli).
        

  2.         Incuber une nuit à 37°C.
        

  3.         Si rien ne pousse sur ces boites, c'est qu'il n'y a pas de contamination.


    Estimation de la compétence :

 


  1.         Transformer par électroporation un aliquot de bactéries électrocompétentes (idéalement décongelé plutôt que fraichement préparé) avec 1ng de plasmide.
            

    •                 Idéalement, utiliser toujours le même plasmide (exemple : pBluescript) provenant d'une même dilution (exemple : préparer 1ml de solution de pBT à 1ng/µl, aliquoter en tubes de 20-100µl et stocker à -20°C)
              

        

  2.         Reprendre le produit d'électroporation avec 1ml de LB sans antibiotique.
        

  3.         Incuber sous agitation pendant 1h à la température adéquate (37°C pour E.coli, 28°C pour A.tumefasciens).
        

  4.         Etaler 10µl, 50µl, 100µl et 200µl sur 4 boites de LB solide avec antibiotiques (avec un seul râteau en étalant d'abord 10µl puis 50µl et ainsi de suite...). Incuber à 37°C (ou 28°C) toute la nuit (ou plus pour A.tumefasciens).
        

  5.         Compter le nombre de colonies obtenues sur la ou les boites où c'est comptable. Pour une boite, on obtient un nombre n de transformants.
        

  6.         Estimer le nombre N de transformants pour 1µg de plasmide de cette manière : N = 1000000 x n / volume étalé. Une efficacité optimale doit être de l'ordre de 10 puissance 8 transformants par µg de plasmide.