Principe :

    Pour mettre au point ce protocole, je me suis librement inspiré du protocole dit "de Mehdi" (protocole avec des antioxydants dans le tampon de broyage, une étape de RNAse et de déprotéinisation qui rendent la méthode très efficace mais un peu trop longue à mon gout), et de celui de Michel (assez rapide et facile à mettre en œuvre mais aux résultats trop variables).

    Le but étant d'avoir un protocole efficace et facile à mettre en œuvre tant au niveau des solutions à préparer (déjà prêtes ou faisables rapidement avec des solutions disponibles couramment dans un laboratoire) qu'au niveau du matériel à utiliser (pistons, tubes eppendorfs, simple centrifugeuse de paillasse, etc.) et, au final, de pouvoir manipuler relativement rapidement avec beaucoup d'échantillons, le tout quasiment "à l'improviste".

    Plus précisément :

    

 

• 
          Les antioxydants (beta-mercaptoéthanol, PVP) empêchent, entre autres, la dégradation des acides nucléiques par les radicaux libérés lors du broyage et permettent donc de broyer à température ambiante et de manipuler les broyats en nombre sans avoir besoin d'imposants bacs à glace ni de centrifuger au fur et à mesure.

 

• 
          Les ARN ne gênent en aucune manière les PCR de criblage auxquels servent les ADN génomiques recherchés. Les étapes visant à s'en débarrasser ont donc été simplement retirées de ce protocole.

 

• 
          La précipitation à l'isopropanol a un triple avantage : elle permet de récupérer moins de protéines qu'une précipitation à l'éthanol, elle nécessite de manipuler un volume moins grand (0.7-1 volume d'isopropanol contre 2.5-3 volumes d'éthanol) ce qui est plus pratique et enfin, la précipitation reste efficace à température ambiante ce qui permet d'utiliser une centrifugeuse de paillasse (contrairement aux précipitation à l'éthanol ou au PEG).

 

• 
          Le tampon TE a un double avantage sur l'eau DNAse-free : le pH favorise la solubilisation des acides nucléiques (même pH que pour les tampons d'élution des kits avec colonnes de silice...) et l'EDTA protège mieux l'ADN contre les traces de nucléases. Les échantillons peuvent se conserver longtemps à 4°C, il n'est donc pas nécessaire d'avoir de la place disponible à -80°C pour stocker les échantillons d'ADN.

 

• 
          L'étape de déprotéinisation est placée avant la précipitation à l'isopropanol pour éviter de faire 2 étapes de précipitation (si on place la déprotéinisation après l'isopropanol, il faut refaire une précipitation après la déprotéinisation).

 

          Durée :

    A déterminer

    

 

          Cout :

    A déterminer

    

 

        Matériel de départ :

 

• 
          Au moins un piston de broyage (idéalement un par échantillon mais on peut nettoyer soigneusement entre chaque broyage).
      
• 
          Une hotte aspirante disponible (à cause des vapeurs de Beta-mercaptoéthanol, de chloroforme et de phénol).
      
• 
          Centrifugeuse pour tubes eppendorfs pas nécessairement réfrigérée, réglée sur la vitesse maximale.
      
• 
          4 tubes eppendorf de 1.5ml par échantillon.

 

           Solutions nécessaires :

 

• 
          Tampon d’Extraction : Tris pH8 0.2M, NaCl 0.25M, EDTA 25mM, SDS 0.5% (p/v), Betamercaptoethanol 2% (v/v) et polyvinylpyrrolidone 1% (p/v) (soit, pour 10ml de tampon, 2ml de Tris 1M, 833µl de NaCl 3M, 500µl d’EDTA 0.5M, 500µl de SDS 10% (0.002€/échantillon), extemporanément, 1ml de PVP 10% filtré et 200µl de beta-mercaptoéthanol pur, eau DNAse-free qsp 10ml). Stocker à température ambiante s’il n’y a pas le beta-mercaptoéthanol ni de PVP, sinon ne se stocke pas.
      
• 
          Phénol/chloroforme/alcool isoamylique : proportions 25/24/1 (soit 1 volume de phénol tamponné (pH 7.8-8.2) pour 1 volume de mélange chloroforme/alcool isoamylique. Laisser décanter quelques heures). Stocker à 4°C. Attention toxique, manipuler sous hotte aspirante et corrosif pour le plastique en polystyrène ! (0.066€/ml soit 0.0132€/échantillon)
      
• 
          Chloroforme/alcool isoamylique : proportions 24/1 (soit 1ml d’alcool isoamylique pour 24ml de chloroforme). Stocker à 4°C. Attention toxique, manipuler sous hotte aspirante et corrosif pour le plastique en polystyrène et polyéthylène! (0.032€/ml soit 0.0064€/échantillon)
      
• 
          Isopropanol(0.0048€/échantillon).
      
• 
          Ethanol 70%.
      
• 
          Tampon de resuspension « TE » :  Tris pH8 10mM et EDTA 1mM (soit, pour 50ml de TE 10x, 5ml de Tris 1M et 1ml d’EDTA 0.5M dans de l’eau DNAse-free qsp 50ml. Autoclaver le tout). Stocker à température ambiante.

 

         Mode opératoire :

 

1. 
           Couper un petit morceau de feuille (ou autre tissu) en utilisant, par exemple, un tube eppendorf comme emporte-pièce et collecter dans un tube eppendorf de 1,5 ml.
       
2. 
           Sous hotte – gants nitrile (bleus) Broyer soigneusement dans 250 µl de Tampon d’Extraction. Nettoyer les pistons?.
       
3. 
           Vortexer quelques secondes et centrifuger 5 min pour sédimenter les débris. Sous hotte Récupérer 200 µl du surnageant dans un tube eppendorf neuf (NB : le reste de broyat, contenant du beta-mercaptoéthanol, est jeté dans la poubelle pour déchets CMR).
       
4. 
           Sous hotte Ajouter 200 µl de Phénol/Chloroforme/Alcool isoamylique. Vortexer. Centrifuger 10 min. Récupérer la phase aqueuse dans un nouveau tube eppendorf, jeter la phase organique dans la poubelle pour solvants halogénés et le tube souillé dans la poubelle pour déchets solides CMR.
       
5. 
           Sous hotte Ajouter 200 µl de mélange Chloroforme/Alcool isoamylique, vortexer, centrifuger 2 min. Récupérer la phase aqueuse dans un nouveau tube eppendorf, jeter la phase organique dans la poubelle pour solvants halogénés et le tube souillé dans la poubelle pour déchets solides CMR.
       
6. 
           Ajouter 200 µl d’Isopropanol. Homogénéiser et centrifuger 10 min. Sous hotte Eliminer le surnageant dans la poubelle pour solvants halogénés (à cause des restes de chloroforme et de beta-mercaptoéthanol).
       
7. 
           Effectuer le lavage en ajoutant au culot 400 µl d’Ethanol 70%, vortexer quelques secondes pour bien diluer les sels et, si besoin, décoller ce qui reste sur la paroi du tube (par exemple avec une pointe de P1000), centrifuger 5 min et éliminer soigneusement le surnageant.
       
8. 
           Sécher le culot 5 min au speedvac et resuspendre dans 50 µl de TE ou d'eau DNAse-free. Dans le TE, l'ADN peut se stocker à 4°C (sinon à -20°C si l'ADN est repris dans l'eau).
       
9. 
           (Optionnel) Passer 5µl sur gel d'agarose pour vérifier la quantité et la qualité des ADN ainsi extraits. Inutile de quantifier précisément au spectrophotomètre puisque l'ADN ainsi obtenu est faiblement dégradé, contient de l'ARN et des impuretés, autant d'éléments qui invalident cette méthode de quantification.
       
10. 
            Utiliser 1 à 5µl d'ADNg par réaction de PCR (1µl habituellement et jusqu'à 5µl si le gel de vérification indique un ADN peu concentré).