Matériel de départ :

• Un tube de 2ml à vis avec un peu de billes de zirconium autoclavés par échantillon.
• 2 tubes eppendorf de 1.5ml par échantillon.
• Un Ribolyser.
• Un bain-marie à 80°C.
• Une hotte aspirante.
• Une centrifugeuse de paillasse (pour les premières étapes) et une centrifugeuse réfrigérée (pour la précipitation mais peut optionnellement servir pour les premières étapes).

 

Solutions nécessaires :

• Azote liquide
• Eau RNAse-free
• Tampon d'extraction : NaCl 0.1M, Tris pH7.5 10mM, EDTA 1mM, DTT 5mM
• Phénol acide (pH 4.5 à 5.5)
• chloroforme/Alcool isoamylique
• SDS 10% (0.0008€/échantillon)
• LiCl 4M
• Ethanol 70%

 

Mode opératoire :

1. Prélever 100mg de tissu dans un tube de 2ml à vis contenant les billes de zirconium. Mettre dans l'azote liquide.
2. Ajouter 480µl de Tampon d'extraction.
3. Ajouter 240µl de phénol acide.
4. Passer au Ribolyser 2 fois 45s à vitesse maximale.
5. Ajouter 5µl de SDS 10%, vortexer 1min.
6. Incuber 2min à 80°C dans un bain-marie, sortir les échantillons et attendre 5-10min que ça refroidisse à température ambiante.
7. Ajouter 240µl de Chloroforme/Alcool isoamylique, vortexer, centrifuger 2min à une vitesse d'au moins 10000g à température ambiante.
8. Récupérer la phase aqueuse dans un nouveau tube eppendorf de 1.5ml.
9. Ajouter 500µl de Chloroforme/Alcool isoamylique, vortexer, centrifuger 2min.
10. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube eppendorf de 1.5ml.
11. Ajouter un volume (500µl) de LiCl 4M et laisser précipiter toute une nuit à 4°C (dans un bac à glace dans la chambre froide par exemple).
12. Centrifuger 30min à une vitesse d'au moins 20000g à 4°C.
13. Vider le surnageant, ajouter 1ml d'éthanol 70%.
14. Centrifuger 30min à une vitesse d'au moins 20000g à 4°C.
15. Vider le surnageant, sécher les culots puis reprendre dans 50µl d'eau RNAse-free.