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Propagation de plasmide

Transformation d’E. coli :

  1. Electroporation d’un aliquote de souche électro-compétente de E. coli TOP10 (ou toute autre souche de multiplication de vecteur plasmidique comme XL1blue ou DH5a) avec 1 µl de plasmide (eg. pGMT-FP16S_DelCerro) très faiblement concentré (eg. ~80 pg/µl pour l’échantillon de pGMT-FP16S_DelCerro).
  2. Expression phénotypique (1 heure à 37 °C) dans 0,5 à 1 ml de SOC stérile (ou SOB ou du LB ou 2xYT) sans antibiotique de sélection.
  3. Etalement de 10 µl et 100 µl sur deux boites de milieu de sélection (eg. LB ou 2xYT agar 15 g/L, supplémentées avec de l’Ampicilline 20 à 100 µg/ml).
  4. Incuber à 37 °C pendant 8 à 12 heures (ie. une nuit), maximum 24 heures pour éviter l’émergence de colonies-satellites.

Sélection de colonies recombinantes par PCR sur colonies

  1. (Optionnel) Repiquer et ordonner plusieurs dizaines de colonies sur une boite de milieu solide avec l’antibiotique de sélection (eg. 2xYT + Ampicilline 100 µg/ml). Incuber jusqu’à l’émergence de nouvelles colonies. Stocker la boite à 4 – 10 °C.
  2. Faire un prémix de (q)PCR avec des amorces adéquates (eg. 16S universelles pour pGMT-FP16S_DelCerro) pour 8 puits (ie. une barrette).
  3. Réserver 2 puits pour les contrôles (1 contrôle positif + 1 contrôle négatif ou blanc).
  4. Avec une pointe de micropipette ou un cure-dent stérile, repiquer 6 colonies sur une nouvelle boite 2xYT + antibiotique puis dans les 6 autres puits en relevant quelle colonie correspond à quel puits.
  5. Effectuer la (q)PCR et relever les puits positifs (avec courbe de fusion pour une qPCR ou un gel d’électrophorèse à 2 % d’agarose pour une PCR classique). Les colonies correspondantes contiennent le plasmide voulu.

Culture de colonie recombinante en milieu liquide

  1. Repiquer une des colonies positives dans 20 ml de milieu liquide avec antibiotique (eg. 2xYT + ampicilline 100 µg/ml dans un flacon ou erlen stérile).
  2. Incuber sous agitation (150 RPM) à 37 °C jusqu’à saturation de la culture.
  3. (Optionnel) Vérifier la pureté de la culture avec une coloration de Gram.
  4. Réaliser au moins 5 tubes de cryoconservation -80 °C (1 ml de culture + 1 ml de tampon glycérol de conservation 2 X), mettre à -80 °C.

Extraction d’ADN plasmidique

  1. Utiliser 5 ml de culture avec un kit d’extraction adapté avec une étape RNAse pour éliminer toute interférence liée aux ARN totaux.
  2. Quantifier l’ADN plasmidique obtenu par spectrophométrie (ie. 260 nm, Nanodrop/Nanoview).
  3. (Optionnel) Vérifier qualité/quantité sur gel Agarose 0,8 %.